Нанотехнологии в диагностике аутоиммунного тиреоидита

 

Аутоиммунный тиреоидит (далее - АИТ) - аутоиммунное заболевание, являющееся наиболее частым из всех болезней щитовидной железы. Его распространенность среди детского населения составляет от 0,1 до 1,2% и от 6 до 10% среди женщин старше 60 лет. В общей популяции на 10-30 взрослых женщин приходится 1 случай заболевания аутоиммунным тиреоидитом. 

Для практического здравоохранения актуальность проблемы патологии щитовидной железы связана, прежде всего, с ее влиянием на репродуктивное здоровье женщин. Как гипотиреоз, так и тиреотоксикоз могут обусловить снижение фертильности у женщин и являются фактором риска нарушений развития эмбриона, так как на протяжении всего периода беременности тиреоидные гормоны обеспечивают развитие большинства органов и систем плода.

Системная красная волчанка (далее - СКВ) - системное аутоиммунное заболевание соединительной ткани неизвестной этиологии, при котором наблюдается гиперпродукция аутоантител к различным компонентам клеток человека. Распространенность СКВ составляет 1-2 случая на 1000 человек. Заболевание наиболее часто развивается у женщин репродуктивного возраста (20-40 лет). В основе патогенеза лежит образование иммунных комплексов с аутоантигенами клеток различных тканей, что вызывает иммунное воспаление и нарушение функции внутренних органов.

Учеными кафедры эндокринологии ГОУ ДПО КГМА Росздрава и Казанского государственного университета разрабатывается высокоспецифичный и чувствительный экспресс-метод диагностики АИТ и СКВ. Методика основана на определении антител в сыворотке крови больных к нативной ДНК с использованием нанобиосенсора - пьезокварцевого ДНК-иммуносенсора и характера их взаимодействия с нативной ДНК в сыворотке крови больных.
 

Проведено комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование 148 женщин, страдавших аутоиммунным тиреоидитом, в возрасте от 18 до 53 лет. Группы контроля составили 40 практически здоровых женщин, не имевших патологии щитовидной железы, и 15 женщин, страдавших СКВ,  рандомизированных по возрасту. Диагноз АИТ и СКВ устанавливался на основании общепринятых методов, согласно Консенсусу (И.И. Дедов и др., 2003). Определение уровня антител к нативной и денатурированной ДНК классов IgG и IgM в сыворотке крови проводилось методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов «IgG-Antibodies to double-stranded DNA», «IgG-Antibodies to single-stranded DNA», «IgМ-Antibodies to double-stranded DNA» («Оrgentec», Германия). Определение антител к нативной ДНК в сыворотке крови с использованием пьезокварцевого биосенсора проводили в газовом и проточно-инжекционном режимах (рис.1А). 

Для определения антител к нДНК в проточно-инжекционном режиме использовали кварцевые микровесы QCM 200 фирмы  Stanford Research Systems (США), ПКР 5 МГц с золотым электродом (рис.1Б). Управление и фиксирование результатов экспериментов осуществлялось с помощью компьютерной программы LabView 1.0. Выделение аутоантител к нативной ДНК класса IgG из сыворотки крови больных АИТ по методу Litman (1968) в модификации, предложенной Невзоровой (2005). Гомогенность выделенных АТ-IgG исследовали по Остерману, 1981. Визуализацию поверхности образцов проводили на атомно-силовом микроскопе Solver P47H кремниевыми кантилеверами NSG 11 в полуконтактном режиме. Обработку АСМ-изображений - с помощью программного обеспечения Nova RC1.0.26.878 компании ЗАО «НТ–MДT», Россия. Подсчет длины молекул ДНК производился с помощью программы DNA Processing Aplication 2.6. Статистический анализ делался с использованием программы Statistica 6.0. Для  оценки симметричных выборок использовали параметры «среднее» и «стандартное отклонение». Для характеристики и сравнения данных, не подчиняющихся закону нормального распределения, применяли непараметрические методы. Достоверность различий оценивали с помощью ранговых критериев: Т-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса. Статистически достоверными считали различия при значении р < 0,05.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

На первом этапе аутоантитела к нативной ДНК в сыворотке крови больных АИТ исследовались иммуноферментным методом. Для определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови использовали инновационный метод - нанобиосенсор на основе пьезокварцевого анализатора. Отличительной особенностью пьезокварцевых иммуносенсоров является сочетание высокой чувствительности, определяемой наноуровнем, и селективности. Данный метод обеспечивает возможность прямой иммунной реакции без применения дополнительных ферментных меток, что упрощает процесс анализа и уменьшает вероятность недостоверных результатов. 

Определение содержания антител к нДНК в сыворотке крови 30 больных АИТ, 10 больных СКВ и 15 здоровых лиц проведено с помощью пьезокварцевого биосенсора в газовом и в проточно-инжекционном режимах. Все больные АИТ имели клинические проявления гипофункции щитовидной железы. Получили аналогичные результаты. Проточно-инжекционный режим является более перспективным и активно развивающимся направлением с применением пьезокварцевых биосенсоров (Marx, 2003). Сдвиг частоты биосенсора в группе больных АИТ в проточно-инжекционном режиме составил 34,1 Гц (2,5 П-21,7; 97,5  П-62,1) и был выше (р<0,005) по сравнению с показателями в группе здоровых - 4,2 Гц (2,5 П-2,2; 97,5 П-14,1) и ниже (р<0,01) по сравнению с больными СКВ - 87,5 Гц (2,5 П-53,6; 97,5 П-100,4). Различия в сдвиге частоты колебаний пьезокварцевого биосенсора, в зависимости от концентрации антител к нДНК в исследуемых сыворотках крови, становятся значимыми уже в течение первых 10-15 минут. 

Проведенные исследования характеризуют метод с использованием пьезокварцевого биосенсора в проточно-инжекционном режиме как высокоспецифичный (87,5%), чувствительный (96,6%), экономичный по времени (экспресс-анализ) способ определения антител к нДНК в сыворотке крови, позволяющий дифференцировать больных АИТ и СКВ от здоровых лиц и эндемического зоба. 

Изучение ДНК-гидролизующей активности выделенных из сыворотки крови больных АИТ и гипотиреозом антител к нативной ДНК проводилось после инкубации их с нативной ДНК цыплят. Для исключения возможного влияния инкубации на изменение длины молекул ДНК исследовали по два препарата нативной ДНК, один из которых инкубировали при 37о С в течение 18 часов, а другой не подвергали такому воздействию. Методом АСМ были получены изображения выделенных антител Ig G шаровидной формы с диаметром 9,8-24,4 нм и средним значением высоты 1,1 нм (рис. 2). На изображениях контрольных препаратов молекулы ДНК имели нитевидную форму с шириной 15,3 нм и высотой 0,71 нм (рис. 3). После инкубации нативной ДНК с выделенными антителами было обнаружено появление низкомолекулярных фрагментов ДНК. Длина молекул ДНК, инкубированных с антителами, составила 295,15 нм (2,5 П - 102,25 нм; 97,5 П - 1171,27 нм) и была значимо меньше по сравнению с длиной молекул ДНК контрольных образцов – 806,0 нм (2,5 П - 172,45 нм; 97,5 П - 1941,5 нм) (р<0,05) Места посадки антител на нитях ДНК характеризовались большими размерами по сравнению со свободной молекулой ДНК. Одни антитела располагались в центре средних по длине молекул ДНК (рис. 4), а другие – на концах коротких и средних по длине молекул ДНК (рис. 5). Взаимодействие антител к ДНК, выделенных из сыворотки крови больных АИТ, и нативной ДНК имело непроцессивный характер, так как после реализации ДНК-гидролиза молекулы антител оставались связанными с нитью ДНК, которая не восстанавливала свою структуру.

 

Рис. 5. АСМ-изображение взаимодействия антител к нДНК с ДНК. Локализация антител на концах нитей ДНК показана стрелками.

Можно предположить наличие у больных АИТ двух типов антител: ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих. Результаты исследования согласуются с данными Невзоровой Т.А. (2005), которая также обнаружила непроцессивный характер взаимодействия ДНК и антител, выделенных из сыворотки крови больных системной красной волчанкой. Говоря о возможной роли ДНК-абзимов при АИТ, с одной стороны, можно предположить или прямой защитный механизм их гидролизующего действия, который заключается в утилизации избытка нуклеосомной ДНК апоптозных клеток, или может указывать на повреждение ДНК и апоптоз при данной патологии. Имеются основания предполагать, что аутоантитела к нативной ДНК, участвуя в регуляции процесса апоптоза, могут отражать начальные изменения в системе иммунологического надзора и выступать в качестве раннего диагностического признака аутоиммунной патологии. Методом атомно-силовой микроскопии показано повреждающее действие ДНК-гидролизующих антител класса IgG на молекулы нативной ДНК, что может указывать на их непосредственное участие в патогенезе аутоиммунного тиреоидита в качестве фактора развития патологии. Гидролизующие свойства антител к ДНК требуют дальнейшего изучения, поскольку это имеет не только фундаментальное значение для более глубокого понимания механизмов развития аутоиммунной патологии, но и может быть найдено практическое применение для разработки новых методов иммунодиагностики.

 

 

 

Источник: журнал «Нанотехнологии Экология Производство»